Effetti dell'insulina sul metabolismo del glucosio nel muscolo cardiaco di ratti spontaneamente ipertesi

Base di partenza scientifica

Il cuore è capace di riorganizzare la propria struttura in risposta allo Stress emodinamico, come il sovraccarico pressorio cronico che si osserva in condizioni di stabile aumento dei valori di pressione arteriosa. In base alla natura dello stimolo fisiopatologico, il rimodellamento strutturale del miocardio può assumere aspetti, forme e dimensioni diverse conducendo allo sviluppo dell'ipertrofia concentrica, eccentrica o dilatativa. Infatti, mentre l'ipertrofia ventricolare sinistra può essere considerata, almeno all'inizio, un meccanismo adattativo per ridurre lo stress parietale, attraverso un aumento di spessore delle pareti ventricolari, il persistere di questa condizione potrebbe essere considerata il primo passo verso quel patologico processo di rimodellamento cardiaco, che conduce progressivamente allo sviluppo dell'insufficienza cardiaca (Chien KR, 1999). I meccanismi molecolari che inizialmente innescano e successivamente sostengono questo processo di riorganizzazione morfo-volumetrica e strutturale del ventricolo sinistro non sono ancora completamente chiariti. In particolare, gli stimoli in grado di evocare una risposta cardiaca di tipo ipertrofico possono essere meccanici (Condorelli G et al., 1999) o neurormonali (Oparil S., 1985). Mentre, i meccanismi con cui i sistemi neurormonali innescano il processo ipertrofico sono stati largamente studiati e caratterizzati, i meccanismi con cui le cellule cardiache percepiscono lo stimolo meccanico e innescano la segnalazione intracellulare che conduce all'attivazione del programma di rimodellamento ipertrofico sono ancora poco conosciuti. Sia i cardiomiociti che le cellule non muscolari sono in grado di sentire il carico Emodinamico. Segnali di crescita sono poi generati dal rilascio di fattori di crescita e citochine che sono in grado di attuare il rimodellamento ipertrofico ventricolare. I fattori che sono stati implicati nella risposta ipertrofica includono peptidi che stimolano recettori accoppiati alle proteine G (endotelina 1) (Shubeita HE et al, 1990 e Yamazaki T et al, 1996), l'angiotensina II (Sadoshima J et al, 1993 e 1996), interleukin-6-related cytokines (cardiotrophin 1) (Wollert KC et al, 1996 e Sheng Z et al, 1997), e e fattori di crescita che attivano recettori tirosino-chinasici (insulin-like growth factor I) (Ito H et al, 1993 e Duerr RL et al, 1995).

I risultati di recenti ricerche suggeriscono che le integrine, proteine strutturali che collegano il citoscheletro alla matrice extracellulare, potrebbero essere implicate nel processo di trasduzione dello stimolo meccanico in segnali biochimici intracellulari, che convergendo sul nucleo attivano il programma di crescita (Ross RS et al., 1998). Recentemente, è stato dimostrato che il dominio intracitoplasmatico delle beta integrine interagisce con la melusina, una proteina specificamente espressa nel tessuto muscolare cardiaco e scheletrico (Brancaccio M et al., 1999). Il ruolo fisiologico della melusina non è stato ancora definito, ma la sua posizione strategica tra il citoscheletro e le integrine fa ipotizzare che possa essere coinvolta nel meccanismo di percezione dello stimolo meccanico da parte delle cellule miocardiche.

La possibilità di disporre di un modello murino di ablazione del Gene che codifica per la melusina, realizzato nel laboratorio del Prof. Guido Tarone, che rappresenta l'altra Unità impegnata in questo progetto di ricerca, ci permetterà di chiarire il ruolo della melusina nel processo di rimodellamento cardiaco sia in risposta allo stress meccanico, realizzato dal sovraccarico pressorio cronico ottenuto mediante costrizione dell'aorta toracica, sia in risposta all'attivazione neuro-ormonale.

Descrizione del programma.

La prima fase dello studio prevede la caratterizzazione del fenotipo cardiaco basale dei topi con ablazione del gene della melusina. In particolare, si valuteranno eventuali alterazioni morfologiche e funzionali cardiache attraverso l'approccio combinato di differenti metodiche di analisi, come l'esame istologico, la massa ventricolare sinistra necroscopica, l'ecocardiografia transtoracica e la contrattilità miocardica mediante misurazione del dP/dt.

In una fase successiva dello studio i topi con ablazione del gene della melusina e i loro rispettivi controlli wild type saranno sottoposti al sovraccarico pressorio cronico (Lembo G et al, 1996). In particolare i topi saranno anestetizzati con una combinazione di ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), intubati e tenuti in ventilazione assistita con un respiratore automatico per roditori (Ugo Basile Co.) ad un ritmo di 75 cicli al minuto e ad un tidal volume di 10mL/kg di peso corporeo. Sarà praticata una sternotomia mediana alta e dopo isolamento dell'arco aortico si realizzerà un restringimento del vaso tra l'origine del tronco anonimo e la carotide sinistra utilizzando un filo di sutura in seta 8-0 legato intorno ad un ago 27G, così da ottenere una riduzione del diametro interno dell'aorta a circa 1 mm ed un gradiente sistolico transtenotico di circa 70 mmHg una volta che l'ago sarà stato rimosso. Il gruppo di controllo sarà costituito da animali sottoposti allo stesso tipo di procedure chirurgiche, ma senza realizzazione del restringimento aortico.

Per verificare se la melusina è selettivamente implicata nel meccanismo di percezione e trasduzione dello stimolo meccanico in segnale trofico o è coinvolta anche nella risposta ipertrofica miocardica alla stimolazione neuro-ormonale, un ulteriore gruppo di animali sarà sottoposto all'infusione per 18 giorni mediante pompe osmotiche (Alza Corp.)impiantate a livello sottocutaneo di dosi subpressorie di agonisti recettoriali, quali la fenilefrina (100 mg/kg/die) (Cavalli A et al, 1997) e l'angiotensina II (0,1 mg/kg/die) (Harada K et al, 1998), che si sono dimostrate in grado di evocare una risposta miocardica di tipo ipertrofico indipendentemente da modificazioni del profilo pressorio. Inoltre, per verificare che le dosi impiegate non sono in grado di perturbare l'omeostasi pressoria, durante tutto il periodo di infusione sarà valutata la pressione arteriosa mediante registrazione radiotelemetrica (Carlson SH et al, 2000) ottenuta incannulando l'arteria femorale con un catetere connesso ad un dispositivo impiantabile (Data Sciences International).

Sia negli animali sottoposti al sovraccarico pressorio cronico sia in quelli sottoposti al trattamento cronico con agonisti recettoriali saranno effettuate valutazioni ecocardiografiche. L'analisi ultrasonografica sarà effettuata con un ecocardiografo HP Sonos 100 equipaggiato con una sonda da 7.5 MHz, opportunamente adattata alle piccole dimensioni del topo. In questo caso gli animali saranno anestetizzati con tribromoetanolo (350 mg/kg). Tutte le misurazioni ecocardiografiche dei diametri cavitari, degli spessori parietali e degli indici di funzione ventricolare sinistra saranno effettuate con un sistema di analisi di immagine computerizzato (NIH IMAGE, Research Service Branch) in accordo con le indicazioni fornite dall'American Society of Echocardiography (Sahn DJ et al, 1978).

Successivamente, gli animali saranno sacrificati, i cuori saranno espiantati, le camere ventricolari destra e sinistra saranno separate e pesate, per la determinazione della massa ventricolare sinistra indicizzata, calcolata come rapporto ventricolo sinistro/peso corporeo, espresso in mg/g. Il tessuto ventricolare sarà poi processato per valutazioni istologiche della risposta stromale e delle dimensioni dei cardiomiociti. Inoltre, sarà analizzata l'attivazione del programma genico embrionale tipico del processo ipertrofico ventricolare (ANF, b-MHC , a-skeletal actin), mediante Northern blot.

Per chiarire i meccanismi attraverso cui la melusina innesca i segnali biochimici intracellulari che conducono all'attivazione del processo ipertrofico in risposta allo stress meccanico, saranno valutate l'attivazione delle MAPK, come JNK. p38 e ERK1 e 2, che le integrine determinano in condizioni di sovraccarico emodinamico.

In un ulteriore gruppo di animali sottoposti al sovraccarico pressorio cronico saranno effettuate valutazioni ecocardiografiche seriate per circa 6 mesi, al fine di stabilire se la mancanza della melusina possa condizionare l'evoluzione dell'ipertrofia ventricolare verso l'insufficienza cardiaca. Questa serie di esperimenti ci permetterà di stabilire se la sopravvivenza in condizioni di stabile aumento del post-carico è influenzata dalla mancanza di melusina.

Bibliografia

Chien KR. Stress pathways and heart failure. Cell 1999 Sep 3;98(5):555-8

Condorelli G, Morisco C, Stassi G, Notte A, Farina F, Sgaramella G, de Rienzo A, Roncarati R, Trimarco B, Lembo G. Increased cardiomyocyte apoptsis and changes in proapoptotic genes bax and bcl-2 during left ventricular adaptations to chronic pressure overload in rats. Circulation 1999;99(23):3071-8

Oparil S. Pathogenesis of ventricular hypertrophy. J Am Coll Cardiol 1985;5(6 Suppl):57B-65B

Ross RS, Pham C, Shai SY, Goldhaber JI, Fenczik C, Glembotski CC, Ginsberg MH, Loftus JC. Beta-1 integrins participate in the hypertrophic response of rat ventricular myocytes. Circ Res 1998;82:1160-72

Shubeita HE, McDonough PM, Harris AN et al. Endothelin induction of inositol phosphatidil hydrolysis, sarcomere assembly and cardiac gene expression in ventricular myocytes: a paracrine mechanism for myocardial cell hypertrophy. J Biol Chem 1990;265:20555-62

Yamazaki T, Komuro I, Kudoh S, et al. Endothelin-1 is involved in mechanical stress-induced cardiomyocyte hypertrophy. J Biol Chem 1996;271:3221-8

Sadoshima J, Izumo S. Molecular characterization of angiotensin II-induced hypertrophy of cardiac myocytes and hyperplasia of cardiac fibroblasts: critical role of the AT1 receptor subtype. Circ Res 1993;73:413-23

Sadoshima J, Izumo S. The heterotrimeric G q protein-coupled angiotensin II receptor activates p21 ras via the tyrosine kinase-Shc-Grb2-Sos pathway in cardiac myocytes. EMBO J 1996;15:775-87

Wollert KC, Taga T, Saito M et al. Cardiotrophin-1 activates a distinct form of cardiac muscle cell hypertrophy: assembly of sarcomeric units in series VIA gp130/leukemia inhibitory factor receptor-dependent pathway. J Biol Chem 1996;271:9535-45

Sheng Z, Knowlton K, Chen J, Hoshijima M, Brown JH, Chien KR. Cardiotrophin 1 (CT-1) inhibition of cardiac myocyte apoptosis via a mitogen-activated protein kinase-dependent pathway: divergence from downstream CT-1 signals for myocardial cell hypertrophy. J Biol Chem 1997;272:5783-91

Ito H, Hiroe M, Hirata Y et al. Insulin-like growth factor-1 induces hypertrophy with enhanced expression of muscle specific genes in cultured rat cardiomyocytes. Circulation 1993;87:1715-21

Duerr RL, Huang S, Miraliakbar HR, Clark R, Chien KR, Ross J Jr. Insulin-like growth factor-1 enhances ventricular hypertrophy and function during the onset of experimental cardiac failure. J Clin Invest 1995;95:619-27

Brancaccio M, Guazzone S, Menini N, Sibona E, Hirsch E, De Andrea M, Rocchi M, Altruda F, Tarone G, Silengo L. Melusin is a new muscle-specific interactor for beta(1) integrin cytoplasmic domain. J Biol Chem 1999;274:29282-8

Lembo G, Rockman HA, Hunter JJ, Steinmetz H, Koch WJ, Ma L, Prinz MP, Ross J Jr, Chien KR, Powell-Braxton L. Elevated blood pressure and enhanced myocardial contractility in mice with severe IGF-1 deficiency. J Clin Invest 199698:2648-55

Cavalli A, Lattion AL, Hummler E, Nenniger M, Pedrazzini T, Aubert JF, Michel MC, Yang M, Lembo G, Vecchione C, Mostardini M, Schmidt A, Beermann F, Cotecchia S. Decreased blood pressure response in mice deficient of the alpha1b-adrenergic receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 1997;94:11589-94

Harada K, Komuro I, Shiojima I, Hayashi D, Kudoh S, Mizuno T, Kijima K, Matsubara H, Sugaya T, Murakami K, Yazaki Y. Pressure overload induces cardiac hypertrophy in angiotensin II type 1A receptor knockout mice. Circulation 1998;97:1952-9

Carlson SH, Wyss JM. Long-term telemetric recording of arterial pressure and heart rate in mice fed basal and high NaCl diets. Hypertension 2000;35:E1-5

Sahn DJ, DeMaria A, Kisslo J, Weyman A. Recommendations regarding quantitation in M-mode echocardiography: results of a survey of echocardiographic measurements. Circulation 1978;58:1072-83

Parole chiave: Ipertrofia miocardica, stress meccanico, integrine, melusina, angiotensina, fenilefrina

Pubblicazioni più significative del responsabile del progetto:

Lembo G, Iaccarino G, Vecchione C, Barbato E, Izzo R, Fontana D, Trimarco B. Insulin modulation of an endothelial nitric oxide component present in alpha2- and beta-adrenergic responses in human forearm. J Clin Invest 1997;100(8):2007-14

Lembo G, Fratta L, Vecchione C, Notte A, Cotecchia S, Trimarco B. Impaired Left Ventricular Hypertrophic Response to Chronic Phenilephrine Infusion in a1b-Adrenergic Receptor Deficient Mice. Circulation 1998; Nov (Suppl): A2216

Claudio PP, Fratta L, Farina F, Howard CM, Stassi G, Numata S, Davis A, Lavitrano M, Volpe M, Wilson JM, Trimarco B, Giordano A, Condorelli G. Adenoviral RB2/p130 gene transfer inhibits smooth muscle proliferation and prevents restenosis after angioplasty. Circ Res 1999; 85:1032-9

Condorelli G, Morisco C, Stassi G, Notte A, Farina F, Sgaramella G, de Rienzo A, Roncarati R, Trimarco B, Lembo G. Increased cardiomyocyte apoptsis and changes in proapoptotic genes bax and bcl-2 during left ventricular adaptations to chronic pressure overload in rats. Circulation 1999;99(23):3071-8